福建苹果酸生物炼制研究进展！
来源：www.derunchem.cn 发布时间：2020年10月20日
苹果酸较早是由Carl Wilhelm Scheele于1785年在苹果汁中分离得到。苹果酸结构上类似于琥珀酸及富马酸，其内在的四碳二元羧酸分子结构拓展了苹果酸的用途，如广泛用于食品添加剂、医药化工领域及作为聚苹果酸的前体物质等。
目前，大多数工业生产的苹果酸通过化学合成方法制备，酶催化法合成仅占一小部分，直接发酵法合成更少。化学合成方法通过加热马来酸得到苹果酸；酶催化法通过微生物中分离得到的富马酸酶转化富马酸得到苹果酸，其中富马酸是由石化资源制得的马来酸转化而来。酶催化法和化学方法的原料均来自石化资源。由可再生糖质原料直接发酵转化制备苹果酸，虽然尚未在工业上广泛应用，但显示出了产品安全特性及原料供应丰富的巨大优势，正在获得越来越多的关注和研发投入。目前，苹果酸与琥珀酸、富马酸共同被美国能源部列为未来12种顶-级生物基平台化学品的首-位，因此，直接发酵法代表了苹果酸生物炼制技术的未来。
1 苹果酸生物炼制研究现状
1.1 发酵原料的范围研究
将可再生生物质转化为生物燃料、化学品及食品添加剂是当前生物化工领域研究的热点课题，许多不同类型的生物质水解产物均可用于制备苹果酸。文献报道：用玉米芯水解产物可生产苹果酸；Rhizopus delemar菌株被用于转化玉米秸秆水解物生产苹果酸，也具有工业应用意义；其他生物质也可被用于苹果酸发酵。这些研究表明，苹果酸生物炼制的原料范围很广。
1.2 菌种的筛选研究
近年来，有17种微生物被用于苹果酸转化研究，这些微生物可分为3种类型：细菌、酵母和丝状真菌。细菌具有发酵周期短、生长快的优点，通常用于有机酸的工业发酵；作为模型微生物，酵母广泛应用于酒精发酵领域，虽然酵母不是重要的苹果酸生产菌种，但由于其代谢能力多样，受到广泛关注；丝状真菌发酵苹果酸较大的优势是营养需求简单，利于产品分离。丝状真菌是重要的苹果酸产生菌，科研人员也多围绕该类菌种开展研究。产苹果酸菌株情况见表1。Jantama等发现，大肠杆菌KJ070能够利用10%的葡萄糖在24 h内生产626 mmol的苹果酸；Crtereal等研究表明，汉逊酵母具有较好的生产苹果酸及其他多种四碳二元羧酸的潜力。
1.3 基本代谢路径研究
类似丁二酸及L-乳酸，苹果酸的合成路径引起人们重视，尤其是其工业化生产调控。作为四碳二羧酸重要的生产菌，大肠杆菌的代谢途径被广泛研究，也可通过琥珀酸产生菌的代谢修饰生产苹果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人们用于苹果酸生产，13C同位素示踪分析表明，Saccharomyces cerevisiae的苹果酸累积通过丙酮酸的羧化、三羧酸循环及其逆循环合成而得；丝状真菌米曲霉的13C同位素示踪分析表明，线粒体内TCA循环(三羧酸循环)的活性对苹果酸的分泌贡献较大。苹果酸生物炼制的中心代谢途径如图1。分析表明，细菌中苹果酸的通量主要来源于草酰乙酸的直接代谢；酵母菌中除了草酰乙酸的代谢外，部分苹果酸来自TCA循环；丝状真菌中除了草酰乙酸代谢和TCA循环代谢外，苹果酸的通量也来自苹果酸酶的直接催化以及乙醛酸循环的代谢。
1.4 关键酶研究
富马酸酶是生产苹果酸的重要酶，特别是由富马酸为原料生产苹果酸时。已在酿酒酵母中检测到富马酸酶，并且在面包酵母细胞中测量到其高比活性。苹果酸酶在大肠杆菌中介导C3代谢物羧化成C4代谢中起重要作用。研究表明，也可以通过用修饰电级再生辅酶来生产苹果酸。此外，在米曲霉中检测到丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶的活性也是影响苹果酸通量高低的主要原因。
苹果酸代谢的关键酶见表2。对这些关键酶的分析表明，产生苹果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且参与TCA和乙醛酸盐循环的合成。
1.5 代谢改造策略研究
通过对苹果酸代谢的全-面研究，尤其是全细胞优化的研究，人们借助代谢途径改造生产多种有机酸，包括C4苹果酸。Ye等通过从Thermococcus kodakarensis中提取苹果酸酶来构建体外人工苹果酸合成途径，发现其对葡萄糖的得率可以达到60%。
为了提高苹果酸的产量，在大肠杆菌中实施了富马酸还原酶的敲除以提升产物，根据苹果酸的通量来源，削弱富马酸酶可以增加苹果酸的产量；同时富马酸酶的过度表达也可以反过来从下游改善其代谢。对于酿酒酵母K-901H，Vid24p基因功能丧失导致了苹果酸脱氢酶累积，进而实现苹果酸产率的提升。所有这些改造策略显着促进产物代谢。苹果酸代谢改造策略及效果如表3。
1.6 发酵工艺研究
对于发酵过程，通常采用3种类型的发酵模型，包括深层发酵、固体发酵和酶催化。Zou等探讨了深层发酵过程并进行了总结。Penicillium sclerotiorum K302可以在有氧条件下高产苹果酸钙(92.0 g/L)，该深层培养工艺具有较大潜力。寄生曲霉CICC40365深层培养8 d可得到55.47 g/L的苹果酸，黄曲霉A-TCC13697和米曲霉QM No.821则可通过固体发酵方法生产苹果酸。酶生物催化和膜分离过程被应用于富马酸和苹果酸生物转化。微生物电渗析与细胞催化相结合的方法也是一个亮点，该方法具有电耗低和外源电子利用的多种底物的优点。
1.7 影响发酵的关键因子研究
影响发酵的主要因素包括溶解氧、中和剂、微生物形态、二氧化碳及细胞状态等。
微生物在有氧(偶尔厌氧)条件下产生苹果酸，其中溶解氧在细胞生长中起关键作用。中和剂如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有机酸发酵过程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3确保了酿酒酵母在整个苹果酸发酵过程中保持很好的发酵指数，其中CaCO3通过保持恒定的pH值在苹果酸生物合成中起重要作用。显着影响氧转移速率的另一种情况是真菌的形态，当丝状真菌在深层培养基中生长时，在不同的发酵过程中形成不同类型的形态。代谢网络显示苹果酸积累的几种途径与CO2固定密切相关，因此CO2影响着苹果酸的发酵。对于苹果酸生产菌大肠杆菌而言，CO2参与磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饥饿条件下对米曲霉中苹果酸生产状况研究表明，氮源亚适量反而会增加苹果酸的代谢，这可能与TCA循环的代谢、细胞呼吸和溶解氧吸收间接相关。
2.1.1 同步糖化发酵研究
纤维素原料转化为高附加值化学品(如苹果酸)主要包括4个加工步骤：原料预处理、水解、发酵和产品回收。由于同步糖化发酵提高了产品的整体转化效率，是未来苹果酸生物炼制研究的重要发展趋势。
2.1.2 提高细胞耐受性的改善策略研究
当碳源从葡萄糖扩展到生物质糖时，必须考虑一系列抑-制剂和所产生的细胞耐受性或适应性。纤维素糖降解过程中形成或释放多种细胞抑-制剂，特别是在预处理过程中。这些抑-制剂对微生物有一定的毒性和负面影响，例如形成的糠醛会导致细胞损伤。研究发现，参与硫同化途径的4种基因转录水平能显着保护细胞免受糠醛氧化应激的影响，也可通过与质膜密切相关的化学和遗传扰动来改善细胞对乙酸抑-制剂的耐受性。如果高浓度抑-制剂在发酵系统中积累，则需要脱毒。
2.1.3 五六碳糖共发酵研究
拓宽生物质糖生物转化苹果酸的基质范围对其未来成功应用至关重要。EMP途径的葡萄糖代谢已经在大多数生物体中得到很好的应用，六碳糖(低聚糖、纤维二糖、淀粉、蔗糖和麦芽糖)都通过EMP途径引入或参与葡萄糖代谢。五碳糖(木糖和阿拉-伯糖)是来自生物质的水解糖中的重要糖成分，含量仅次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同发酵苹果酸对工业制备苹果酸具有重要意义。六碳糖和五碳糖的共代谢途径见图2。
2.1.4 碳固定化的强化研究
CO2是温室气体的主要成分，在苹果酸发酵过程中将CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中会产生较大的益处。CO2的固定效率对苹果酸的生产有积级作用，碳固定的关键酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和苹果酸酶。Rhizopus delemar胞内的苹果酸酶活性非常高，在苹果酸的总产量中，突变菌株中检测到20%的通量来自苹果酸酶对CO2的直接固定化。
2.1.5 能量平衡改善代谢研究
对于苹果酸合成的基本代谢，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶合成途径差异显着，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化为OAA(草酰乙酸)的过程净消耗ATP。当在产生苹果酸的菌株代谢中检测到PEPCK和PC时，细胞的ATP能量平衡将起决定性作用；因此，在了解细胞能量供应时，分析能量平衡很关键。类似琥珀酸等四碳二羧酸的发酵，能量不平衡也是菌种高产的瓶颈。当NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-还原态，还原型辅酶Ⅰ)细胞供应不足时，可以通过氧化还原平衡和调节NADH/NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化态)比例提升系统能量的稳定；同时通过乙酰辅酶A代谢，可以另外获得NADH，因此可以通过控制电子传递链来产生ATP。NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶Ⅱ)则在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的苹果酸生物转化中起重要作用。如果一个菌株中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的代谢成功启动，这个关键途径将产生双倍还原力(NADPH)，以补偿能量供应，并进而缓解整体代谢还原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，这是一种有效改善NADHP平衡的方法。
2.2 苹果酸生物精炼研究的总体趋势
2004年，美国能源部将苹果酸列为未来高附加值生物基化学品的首-位，苹果酸将广泛应用于化工、食品和制药等各领域。由于人体只能代谢L-型苹果酸，研究人员已经提出逐渐使用L-苹果酸代替混合型DL-苹果酸，特别是在食品和医药应用中，欧美已经禁止混合型产品的乱用。由于大多数苹果酸产品是通过化学方法合成的，而富马酸酶的催化不是真正的一步发酵，并且反应中存在其他化学残留的可能，因此，苹果酸的一步法生物精炼技术具有重要发展前景。
未来苹果酸生物炼制研究总体趋势为，在原料利用上实现同步糖化发酵，利用细胞耐受性的改善提高其发酵适应性，并进而提升碳糖的共发酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升苹果酸产量。
3 结束语
利用生物炼制手段转化可再生糖制备苹果酸具有重要意义，其未来的发展定位是将原来的淀粉质糖水解系统逐渐过渡到纤维质水解糖系统，而如何克服其生物转化过程中的诸多限制因素至关重要。本文介绍和总结了苹果酸生物炼制流程，包括原料选择、菌种筛选、基本代谢路径研究、关键酶研究、发酵工艺研究以及关键影响因子研究；同时，统筹分析了转化生物体的内部代谢与外在条件之间的关联，进而提出苹果酸生物转化研究的发展趋势，期望为苹果酸生物精炼提供一定参考。
目前，大多数工业生产的苹果酸通过化学合成方法制备，酶催化法合成仅占一小部分，直接发酵法合成更少。化学合成方法通过加热马来酸得到苹果酸；酶催化法通过微生物中分离得到的富马酸酶转化富马酸得到苹果酸，其中富马酸是由石化资源制得的马来酸转化而来。酶催化法和化学方法的原料均来自石化资源。由可再生糖质原料直接发酵转化制备苹果酸，虽然尚未在工业上广泛应用，但显示出了产品安全特性及原料供应丰富的巨大优势，正在获得越来越多的关注和研发投入。目前，苹果酸与琥珀酸、富马酸共同被美国能源部列为未来12种顶-级生物基平台化学品的首-位，因此，直接发酵法代表了苹果酸生物炼制技术的未来。
1 苹果酸生物炼制研究现状
1.1 发酵原料的范围研究
将可再生生物质转化为生物燃料、化学品及食品添加剂是当前生物化工领域研究的热点课题，许多不同类型的生物质水解产物均可用于制备苹果酸。文献报道：用玉米芯水解产物可生产苹果酸；Rhizopus delemar菌株被用于转化玉米秸秆水解物生产苹果酸，也具有工业应用意义；其他生物质也可被用于苹果酸发酵。这些研究表明，苹果酸生物炼制的原料范围很广。
1.2 菌种的筛选研究
近年来，有17种微生物被用于苹果酸转化研究，这些微生物可分为3种类型：细菌、酵母和丝状真菌。细菌具有发酵周期短、生长快的优点，通常用于有机酸的工业发酵；作为模型微生物，酵母广泛应用于酒精发酵领域，虽然酵母不是重要的苹果酸生产菌种，但由于其代谢能力多样，受到广泛关注；丝状真菌发酵苹果酸较大的优势是营养需求简单，利于产品分离。丝状真菌是重要的苹果酸产生菌，科研人员也多围绕该类菌种开展研究。产苹果酸菌株情况见表1。Jantama等发现，大肠杆菌KJ070能够利用10%的葡萄糖在24 h内生产626 mmol的苹果酸；Crtereal等研究表明，汉逊酵母具有较好的生产苹果酸及其他多种四碳二元羧酸的潜力。
1.3 基本代谢路径研究
类似丁二酸及L-乳酸，苹果酸的合成路径引起人们重视，尤其是其工业化生产调控。作为四碳二羧酸重要的生产菌，大肠杆菌的代谢途径被广泛研究，也可通过琥珀酸产生菌的代谢修饰生产苹果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人们用于苹果酸生产，13C同位素示踪分析表明，Saccharomyces cerevisiae的苹果酸累积通过丙酮酸的羧化、三羧酸循环及其逆循环合成而得；丝状真菌米曲霉的13C同位素示踪分析表明，线粒体内TCA循环(三羧酸循环)的活性对苹果酸的分泌贡献较大。苹果酸生物炼制的中心代谢途径如图1。分析表明，细菌中苹果酸的通量主要来源于草酰乙酸的直接代谢；酵母菌中除了草酰乙酸的代谢外，部分苹果酸来自TCA循环；丝状真菌中除了草酰乙酸代谢和TCA循环代谢外，苹果酸的通量也来自苹果酸酶的直接催化以及乙醛酸循环的代谢。
1.4 关键酶研究
富马酸酶是生产苹果酸的重要酶，特别是由富马酸为原料生产苹果酸时。已在酿酒酵母中检测到富马酸酶，并且在面包酵母细胞中测量到其高比活性。苹果酸酶在大肠杆菌中介导C3代谢物羧化成C4代谢中起重要作用。研究表明，也可以通过用修饰电级再生辅酶来生产苹果酸。此外，在米曲霉中检测到丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶的活性也是影响苹果酸通量高低的主要原因。
苹果酸代谢的关键酶见表2。对这些关键酶的分析表明，产生苹果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且参与TCA和乙醛酸盐循环的合成。
1.5 代谢改造策略研究
通过对苹果酸代谢的全-面研究，尤其是全细胞优化的研究，人们借助代谢途径改造生产多种有机酸，包括C4苹果酸。Ye等通过从Thermococcus kodakarensis中提取苹果酸酶来构建体外人工苹果酸合成途径，发现其对葡萄糖的得率可以达到60%。
为了提高苹果酸的产量，在大肠杆菌中实施了富马酸还原酶的敲除以提升产物，根据苹果酸的通量来源，削弱富马酸酶可以增加苹果酸的产量；同时富马酸酶的过度表达也可以反过来从下游改善其代谢。对于酿酒酵母K-901H，Vid24p基因功能丧失导致了苹果酸脱氢酶累积，进而实现苹果酸产率的提升。所有这些改造策略显着促进产物代谢。苹果酸代谢改造策略及效果如表3。
1.6 发酵工艺研究
对于发酵过程，通常采用3种类型的发酵模型，包括深层发酵、固体发酵和酶催化。Zou等探讨了深层发酵过程并进行了总结。Penicillium sclerotiorum K302可以在有氧条件下高产苹果酸钙(92.0 g/L)，该深层培养工艺具有较大潜力。寄生曲霉CICC40365深层培养8 d可得到55.47 g/L的苹果酸，黄曲霉A-TCC13697和米曲霉QM No.821则可通过固体发酵方法生产苹果酸。酶生物催化和膜分离过程被应用于富马酸和苹果酸生物转化。微生物电渗析与细胞催化相结合的方法也是一个亮点，该方法具有电耗低和外源电子利用的多种底物的优点。
1.7 影响发酵的关键因子研究
影响发酵的主要因素包括溶解氧、中和剂、微生物形态、二氧化碳及细胞状态等。
微生物在有氧(偶尔厌氧)条件下产生苹果酸，其中溶解氧在细胞生长中起关键作用。中和剂如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有机酸发酵过程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3确保了酿酒酵母在整个苹果酸发酵过程中保持很好的发酵指数，其中CaCO3通过保持恒定的pH值在苹果酸生物合成中起重要作用。显着影响氧转移速率的另一种情况是真菌的形态，当丝状真菌在深层培养基中生长时，在不同的发酵过程中形成不同类型的形态。代谢网络显示苹果酸积累的几种途径与CO2固定密切相关，因此CO2影响着苹果酸的发酵。对于苹果酸生产菌大肠杆菌而言，CO2参与磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饥饿条件下对米曲霉中苹果酸生产状况研究表明，氮源亚适量反而会增加苹果酸的代谢，这可能与TCA循环的代谢、细胞呼吸和溶解氧吸收间接相关。
2.1.1 同步糖化发酵研究
纤维素原料转化为高附加值化学品(如苹果酸)主要包括4个加工步骤：原料预处理、水解、发酵和产品回收。由于同步糖化发酵提高了产品的整体转化效率，是未来苹果酸生物炼制研究的重要发展趋势。
2.1.2 提高细胞耐受性的改善策略研究
当碳源从葡萄糖扩展到生物质糖时，必须考虑一系列抑-制剂和所产生的细胞耐受性或适应性。纤维素糖降解过程中形成或释放多种细胞抑-制剂，特别是在预处理过程中。这些抑-制剂对微生物有一定的毒性和负面影响，例如形成的糠醛会导致细胞损伤。研究发现，参与硫同化途径的4种基因转录水平能显着保护细胞免受糠醛氧化应激的影响，也可通过与质膜密切相关的化学和遗传扰动来改善细胞对乙酸抑-制剂的耐受性。如果高浓度抑-制剂在发酵系统中积累，则需要脱毒。
2.1.3 五六碳糖共发酵研究
拓宽生物质糖生物转化苹果酸的基质范围对其未来成功应用至关重要。EMP途径的葡萄糖代谢已经在大多数生物体中得到很好的应用，六碳糖(低聚糖、纤维二糖、淀粉、蔗糖和麦芽糖)都通过EMP途径引入或参与葡萄糖代谢。五碳糖(木糖和阿拉-伯糖)是来自生物质的水解糖中的重要糖成分，含量仅次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同发酵苹果酸对工业制备苹果酸具有重要意义。六碳糖和五碳糖的共代谢途径见图2。
2.1.4 碳固定化的强化研究
CO2是温室气体的主要成分，在苹果酸发酵过程中将CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中会产生较大的益处。CO2的固定效率对苹果酸的生产有积级作用，碳固定的关键酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和苹果酸酶。Rhizopus delemar胞内的苹果酸酶活性非常高，在苹果酸的总产量中，突变菌株中检测到20%的通量来自苹果酸酶对CO2的直接固定化。
2.1.5 能量平衡改善代谢研究
对于苹果酸合成的基本代谢，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶合成途径差异显着，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化为OAA(草酰乙酸)的过程净消耗ATP。当在产生苹果酸的菌株代谢中检测到PEPCK和PC时，细胞的ATP能量平衡将起决定性作用；因此，在了解细胞能量供应时，分析能量平衡很关键。类似琥珀酸等四碳二羧酸的发酵，能量不平衡也是菌种高产的瓶颈。当NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-还原态，还原型辅酶Ⅰ)细胞供应不足时，可以通过氧化还原平衡和调节NADH/NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化态)比例提升系统能量的稳定；同时通过乙酰辅酶A代谢，可以另外获得NADH，因此可以通过控制电子传递链来产生ATP。NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶Ⅱ)则在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的苹果酸生物转化中起重要作用。如果一个菌株中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的代谢成功启动，这个关键途径将产生双倍还原力(NADPH)，以补偿能量供应，并进而缓解整体代谢还原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，这是一种有效改善NADHP平衡的方法。
2.2 苹果酸生物精炼研究的总体趋势
2004年，美国能源部将苹果酸列为未来高附加值生物基化学品的首-位，苹果酸将广泛应用于化工、食品和制药等各领域。由于人体只能代谢L-型苹果酸，研究人员已经提出逐渐使用L-苹果酸代替混合型DL-苹果酸，特别是在食品和医药应用中，欧美已经禁止混合型产品的乱用。由于大多数苹果酸产品是通过化学方法合成的，而富马酸酶的催化不是真正的一步发酵，并且反应中存在其他化学残留的可能，因此，苹果酸的一步法生物精炼技术具有重要发展前景。
未来苹果酸生物炼制研究总体趋势为，在原料利用上实现同步糖化发酵，利用细胞耐受性的改善提高其发酵适应性，并进而提升碳糖的共发酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升苹果酸产量。
3 结束语
利用生物炼制手段转化可再生糖制备苹果酸具有重要意义，其未来的发展定位是将原来的淀粉质糖水解系统逐渐过渡到纤维质水解糖系统，而如何克服其生物转化过程中的诸多限制因素至关重要。本文介绍和总结了苹果酸生物炼制流程，包括原料选择、菌种筛选、基本代谢路径研究、关键酶研究、发酵工艺研究以及关键影响因子研究；同时，统筹分析了转化生物体的内部代谢与外在条件之间的关联，进而提出苹果酸生物转化研究的发展趋势，期望为苹果酸生物精炼提供一定参考。
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